無菌實(shí)驗(yàn)室的要求與日常管理需要怎么做？
發(fā)布時間：2021-07-16 16:25
無菌室亦稱無塵室、潔凈室或清凈室。無菌室的主要功能為室內(nèi)污染控制，沒有無菌室，污染敏感零件不可能批量生產(chǎn)。在FED-STD-2里面，無菌室被定義為具備空氣過濾、分配、優(yōu)化、構(gòu)造材料和裝置的房間，其中特定的規(guī)則的操作程序以控制空氣懸浮微粒濃度，從而達(dá)到適當(dāng)?shù)奈⒘崈舳燃墑e。那么每一個區(qū)域的詳細(xì)技術(shù)操作和試劑在下面詳細(xì)列出。
1、樣品準(zhǔn)備區(qū)
這個區(qū)域?qū)ｉT用作樣品的準(zhǔn)備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時應(yīng)該采納預(yù)防措施：
1)PCR產(chǎn)品和帶有要擴(kuò)增序列的DNA克隆不能在這個房間操作。
2)組織培育物、組織標(biāo)本和血清樣品都帶進(jìn)樣品準(zhǔn)備間處理，以依據(jù)應(yīng)用的需求提取DNA或RNA。
3)用于樣品處理的東西不能被用作一般分子克隆的東西，也不能用作操作靶序列。
4)DNA樣品應(yīng)該用有專門的防護(hù)或正壓活塞式移液管操作，以防止在羅致樣品時有氣溶膠留傳。
5)大體積樣品應(yīng)該用獨(dú)自包裝的無菌一次性移液管羅致。
6)管子翻開前都要簡短離心以削減氣溶膠的發(fā)生，并且管子不能用力崩開，這樣會發(fā)生氣溶膠。
7)任何時候都應(yīng)該穿實(shí)驗(yàn)服和帶手套，手套要經(jīng)常替換，尤其在抽提進(jìn)程中每一步之間都要替換。實(shí)驗(yàn)服要專門用于樣品準(zhǔn)備間，經(jīng)常清洗。
2、樣品準(zhǔn)備和RNA-PCR
RNA-PCR的額外步驟需求額外的樣品操作，這樣增加了樣品之間污染的時機(jī)。為了防止這一問題，反轉(zhuǎn)錄一步可以在樣品準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行。在RNA-PCR中應(yīng)用UNG以防止污染的方法也有報道。
3、前PCR區(qū)
有必要有專門用于準(zhǔn)備各種反應(yīng)的區(qū)域，這個區(qū)域有必要堅持潔凈，并且沒有來自克隆和樣品準(zhǔn)備的污染。前PCR區(qū)有必要要有試劑和準(zhǔn)備，特別是專門用于前PCR區(qū)的正壓活塞式移液管。
4、PCR實(shí)驗(yàn)室試劑的操作
1)所用的全部溶液都應(yīng)該沒有核酸和(或)核酸酶(DNase和RNase)污染。
2)全部PCR試劑中運(yùn)用的水都應(yīng)該是高質(zhì)量的-新鮮蒸餾的去離子水，用0.22μm過濾的，并且是高壓滅菌。
3)在20℃到25℃儲存的試劑主張加點(diǎn)像疊氮鈉一類的抗微生物劑，在擴(kuò)增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不克制擴(kuò)增反應(yīng)。
4)所用試劑都應(yīng)該以大體積制作，實(shí)驗(yàn)一下看試劑是否滿足，然后分裝成僅夠一次運(yùn)用的量進(jìn)行儲存。
5)全部試劑和樣品準(zhǔn)備進(jìn)程中都要運(yùn)用一次性滅菌的瓶子和管子。
6)新制作的試劑在用于準(zhǔn)備新的標(biāo)本之前應(yīng)該加以查驗(yàn)。
7)樣品準(zhǔn)備和前PCR區(qū)所運(yùn)用的移液管在不運(yùn)用時都應(yīng)該當(dāng)心保存。
5、在前PCR區(qū)樹立PCR混合物
1)可以把立刻可用的“主混合物”溶液配好、分裝并保存在-20℃或4℃，在實(shí)驗(yàn)室只涉及到擴(kuò)增一種或少數(shù)幾種特異序列時這樣做很有用。
2)如果你的實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用多套引物，以致于制作包括全部試劑的單一反應(yīng)混合物不行經(jīng)濟(jì)，可以考慮分裝保存夠一天的PCR成分。
3)作為一個規(guī)矩，應(yīng)該保存一套陰性、弱陽性和強(qiáng)陽性對照樣品來分析樣品制作和PCR前進(jìn)程的功率和潔凈程度。并且，你也期望通過運(yùn)用一個已知的弱陽性樣品來驗(yàn)證你的樣品緩沖液以證明里邊不含擴(kuò)增克制物。
4)陰性樣品要與每組樣品一起做，以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產(chǎn)品的污染，陰性對照應(yīng)該包括核酸以外的全部試劑。
5)當(dāng)做陽性對照時，有兩個理由決議了應(yīng)該運(yùn)用最少數(shù)量的核酸。
6)因?yàn)橛斜匾袑φ辗磻?yīng)，對照模板的特色應(yīng)該予以考慮。
6、控制污染的方法
已規(guī)劃出很有力的酶學(xué)方法用來消除一種形式的污染?運(yùn)用UNG，這一技術(shù)能有效地消除由PCR產(chǎn)品引起的污染。另一種控制污染的方法是運(yùn)用紫外線，這種方法不能徹底消除污染問題，但可以將污染下降幾個數(shù)量級。
7、PCR儀的方位
8、后PCR區(qū)
PCR結(jié)束后，需求分析樣品并說明數(shù)據(jù)，應(yīng)該留出一個專門用于反應(yīng)后處理樣品的當(dāng)?shù)?。后PCR活動中運(yùn)用的所用試劑、一次性耗材和儀器都有必要是專門用于這一目的，決不能把實(shí)驗(yàn)室這一區(qū)域的試劑或儀器用于任何前PCR活動。
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